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      釀酒酵母表達基因工程抗菌肽Pa-AMP05 的抗菌活性研究
      欄目:關于抗菌肽 發布時間:2018-07-23
      抗菌肽Pa-AMP05 的高效抗菌性能

      [摘要] 本實驗采用瓊脂擴散和稀釋法,對發酵得到的基因工程抗菌肽Pa-AMP05 的抗菌活性進行研究,結果表明,抗菌肽Pa-AMP05 具有較強的抑制大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的活性,對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)為15.625 μg/mL,對大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)為31.25 μg/mL;且其濃度與抗菌活性呈線性正相關。
      [關鍵詞] 基因工程抗菌肽;OD600值;最低抑菌濃度;抗菌活性;線性回歸


      抗菌肽在體外可直接殺滅病原微生物,具有廣譜抗菌活性:不僅可以抗革蘭氏陽性菌(G+)、革蘭氏陰性菌(G-)和真菌、原蟲等多種病原微生物,還可以抗腫瘤和癌細胞,甚至可以直接殺滅流感、皰疹等有包膜的病毒,是宿主防御外界病原體入侵的重要分子屏障。目前抗菌肽已在醫藥、食品防腐、化妝品及動物養殖領域等應用?;蚬こ炭咕鶳a-AMP05 為釀酒酵母分泌型表達,主要存在于發酵液的上清液中,具有多項免疫功能(王凱等,2009a,b;皮燦輝等,2008)及較高的穩定性,且動物試驗表明,其可以顯著促進動物生產性能和健康水平(李永新等2009,羅治華等,2009)。本實驗通過瓊脂擴散法、微量稀釋法和常量稀釋法,對其抗菌活性進行研究,以此確證基因工程抗菌肽Pa-AMP05 的高效抗菌性能。

        1、 材料與方法  

      1.1 實驗材料

      基因工程抗菌肽Pa-AMP05發酵液(抗菌肽含量:500 μg/mL)由深圳市圣西馬生物技術有限公司提供。指示菌大腸桿菌ATCC25922與金黃色葡萄球ATCC29213 由華南農業大學獸醫學院提供。


      1.2 實驗方法
      1.2.1 基因工程抗菌肽Pa-AMP05 發酵過濾液的制備
      吸取10 mL 的基因工程抗菌肽Pa-AMP05發酵液原液分裝到離心管,10000r/min離心10min,經孔徑為0.22μm無菌濾膜過濾,備用。


      1.2.2 大腸桿菌和金黃色葡萄球的制備

      將大腸桿菌和金黃色葡萄球接入LB 液體培養基中,37℃培養,使其菌數達到1×109 CFU/mL,備用。


      1.2.3 瓊脂擴散法

      參照藥敏試驗中瓊脂打孔擴散法,把金黃色葡萄球菌和大腸桿菌原菌液濃度調至1×105 CFU/mL,將細菌均勻涂布到LB 培養基上,將滅菌的不銹鋼小管(外徑為5 mm)放置在培養基上打孔,將孔中的培養基用滅菌針頭挑出,并以火焰封底,使培養基能充分與平皿融合(以防藥液滲漏,影響結果)。
      加樣:1號和2號孔分別加入發酵過濾液,陽性(+)孔加入抗生素(100μg/mL Zeocin,Invitro-gen)、陰性(-)孔加入空載體酵母發酵過濾液,各加至滿而不溢為止。將平皿培養基置于37 ℃溫箱中培養15 h后,觀察抑菌結果并測量抑菌圈直徑。


      1.2.4 微量稀釋法檢測抗菌肽抗菌活性
      ①最小抑菌濃度(MIC)的測定
      把已培養好的大腸桿菌與金黃色葡萄球菌原菌液用LB液體培養基稀釋到1000倍(1×106 CFU/mL)。
      在96孔板每個孔加入空白LB液體培養基100μL。根據設計的實驗濃度,在第一列加入100μL待測樣品,吸取100μL至第二孔,上下吹打,混合均勻后吸取100μL至第三孔,第4耀8孔操作相同,最后100 μL 棄去。這樣每孔對應的體積分數為1、1/2、1/4、1/8。第9 孔和第10 孔分別做陽性對照(青霉素鈉)和陰性對照(滅菌水)??股兀ㄇ嗝顾剽c200μg/mL)操作方法同上。最后在每孔中加入100μL稀釋好的菌液,放入恒溫培養箱中過夜培養。


      ②結果判斷
      以在小孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC。當陽性對照孔(即不含抗菌物質)內細菌明顯生長試驗才有意義。當在微量肉湯稀釋法出現單一的跳孔時,應記錄抑制細菌生長的最高藥物濃度。如出現多處跳孔,則不應報告結果,需重復試驗。


      1.2.5 常量稀釋法檢測抗菌肽抗菌活性
      參照藥敏試驗中常量肉湯稀釋法,略有改動。
      ①培養物的制備及培養檢測
      按照不同稀釋比例:1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64 配置含有發酵過濾液的LB 液體培養基,分為7 個平行管,其中3管按1%接種量接入大腸桿菌,另3管按1%接種量接入金黃色葡萄球菌,同時留一管作為對照管,不接菌種。以無菌水與2 倍濃度LB培養基按1頤1 混合溶液作為陰性對照,以無菌水為檢測OD600值所用參比樣品。將以上所有試管封口后放入37℃的恒溫搖床(250 r/min)里培養12h,檢測其OD600值。


      ②抗菌活性的檢測
      終OD600值=樣品OD600值-相應消除管OD600值。


      ③抗菌肽濃度與抗菌活性的線性關系測定
      將檢測得到的終OD600值與抗菌肽發酵過濾液稀釋倍數做線性回歸分析,根據R2值判斷二者是否具有線性關系,以此證明抗菌肽濃度與抗菌活性的線性關系。


        2、數據與結果  

      2.1 瓊脂擴散法檢測基因工程抗菌肽Pa -AMP05 抗菌活性
      實驗發現,抗菌肽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有較好的抑菌效果。其對金黃色葡萄菌的抑菌圈直徑大小為12mm,與抗生素陽性對照(100μg/mL Zeocin)相同。對大腸桿菌的抑菌圈大小為15mm ,與抗生素陽性對照(100μg/mL Zeocin)相同。

      2.2 微量稀釋法檢測基因工程抗菌肽Pa -AMP05 抗菌活性

      通過微量稀釋法檢測出抗菌肽及青霉素鈉的MIC值,結果見表1 所示。

      表1 微量稀釋法檢測基因工程抗菌肽Pa-AMP05抗菌活性

      注:肉眼測試:很清亮用“-”表示;略微渾濁但沒有達到陰性對照渾濁程度用“+”表示;與陰性對照渾濁程度一樣用“++”表示。其中,抗生素為青霉素鈉200μg/ml,抗菌肽發酵液中抗菌肽Pa-AMP05的含量為500μg/L。


      結果測得青霉素鈉對金黃色葡萄球菌的MIC值為:3.125μg/mL,對大腸桿菌的MIC值為:25μg/mL??咕膶瘘S色葡萄球菌MIC值均為15.625μg/mL,對大腸桿菌的MIC值均為31.25μg/mL。


      2.3 常量稀釋法檢測基因工程抗菌肽Pa -AMP05 抗菌活性
      結果見表2。結果表明,以基因工程抗菌肽發酵過濾液的稀釋倍數為橫坐標,分別以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養液的OD600 值為縱坐標,做線性回歸分析,結果如圖1、2。結果表明,回歸方程分別為y=0.0206x-0.0952,R2=0.967;y=0.0051x+0.0234,R2=0.9749,即抗菌肽濃度與抗菌活性呈一定的線性正相關關系。


      表2 常量稀釋法檢測基因工程抗菌肽Pa-AMP05抗菌活性

      注:其中OD600值均為消除培養基顏色影響后的結果,陰性對照(大腸桿菌)OD600=1.692,陰性對照(金黃色葡萄球菌)OD600=1.995,P<0.05。



       


      基因工程抗菌肽Pa-AMP05濃度與大腸桿菌抗菌活性的線性關系



      基因工程抗菌肽Pa-AMP05濃度與金黃色葡萄球菌抗菌活性的線性關系

        3、結論  

      目前,瓊脂擴散法、微量稀釋法和常量稀釋法為常用的抗菌活性檢測方法,通過測定發現,基因工程抗菌肽Pa-AMP05具有較強的抑制大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的活性,對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)為15.625μg/mL,對大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)為31.25μg/mL;同時檢測的青霉素鈉對金黃色葡萄球菌的MIC值為:3.125μg/mL,對大腸桿菌的MIC值為:25μg/mL。通過線性回歸分析表明,基因工程抗菌Pa-AMP05的濃度與抗金黃色葡萄球菌活性呈一定的線性正相關關系。本試驗中由于抗菌肽Pa-AMP05對大腸桿菌的MIC值低于對金黃色葡萄球菌的MIC值,做回歸方程所選取的數據,稀釋倍數最高達到64倍,遠遠高于抗菌肽Pa-AMP05對大腸桿菌的MIC值范圍,導致回歸方程截距為負值,但是這并不影響其線性關系的判斷,即抗菌肽Pa-AMP05的抗菌活性強弱可以反映出發酵液中抗菌肽濃度的高低。此試驗結果說明,基因工程抗菌肽Pa-AMP05對所選取的代表性G+、G-具有很好的抑菌活性,具有廣譜的抗細菌性能。

        本篇重點摘錄  

      通過瓊脂擴散法、微量稀釋法和常量稀釋法檢測抗菌肽Pa-AMP05的抗菌活性,發現:
      1.基因工程抗菌肽Pa-AMP05的濃度與抗金黃色葡萄球菌活性呈一定線性正相關關系。

      2.由于抗菌肽Pa-AMP05對大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC值)低于對金黃色葡萄球菌MIC值,做回歸方程選取的數據,稀釋倍數最高達64倍,導致回歸方程截距為負,但不影響其線性關系的判斷,即抗菌肽Pa-AMP05的抗菌活性強弱可以反映出發酵液中抗菌肽濃度的高低。

      3.基因工程抗菌肽Pa-AMP05對所選取的代表性G+、G-具有很好的抑菌活性,具有廣譜的抗細菌性能。

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